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Nature:中国科学院、川大合作新成果!DNA碱基编辑器或能诱导大量脱靶RNA突变!

时间:2019-06-12 作者: 点击:0次

  近日,一项刊登在国际杂志Nature上的研究报告中,来自中国科学院和四川大学等机构的科学家们通过研究发现,DNA碱基编辑器能够产生成千上万个脱靶的RNA单核苷酸变异(SNVs),同时通过将点突变引入脱氨酶或能消除这些脱靶的SNVs;本文研究揭示了此前DNA碱基编辑器风险中被忽略的一方面,同时研究者通过引入工程化的脱氨酶或有望解决这一问题。

  图片来源:CC0 Public Domain

  DNA碱基编辑方法能够直接在基因组DNA中进行点突变的校正,同时并不会产生任何双链的断裂(DSBs,double-strand breaks),但潜在的脱靶效应常常限制了这些方法的应用,腺相关病毒(AAV)是DNA编辑基因疗法中最常用的传递系统,由于这些病毒能够在体内持续维持基因表达的功能,因此DNA碱基编辑器所诱导的潜在RNA脱靶效应的程度在临床中得到了极大的关注。

  此前多项研究都评估了因DNA碱基编辑器所诱导的基因组DNA脱靶突变,同时常用的DNA碱基编辑器所必须的脱氨酶通常会表现出DNA的结合活性,比如,胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)中所使用的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1能够靶向作用DNA和RNA,而腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)中的腺嘌呤脱氨酶TadA则会诱导RNA上的位点特异性肌苷形成,然而DNA碱基编辑器所诱发的任何潜在RNA突变,研究人员并未进行评估。

  为了在RNA水平下评估DNA碱基编辑器所引发的脱靶效应,研究人员计算了每个CBE和ABE处理的细胞中每次复制产生的脱靶RNA SNVs的数量,并通过工程化的DNA碱基编辑器脱氨酶来探索是否能够有效消除脱靶RNA SNVs。文章中,研究者将BE3 (APOBEC1-nCas9-UGI)(一种CBE)、ABE7.10 (TadA-TadA*-nCas9)(一种ABE)及携带或不携带单链RNA的GFP转染到HEK293T培养的细胞中,在证实了BE3和ABE7.10对HEK293T细胞的DNA高效编辑效率后,研究者以平均125X的深度对样本进行了RNA测序,并定量评估了每个复制细胞中的RNA SNVs。

  为了保证高效的编辑,每个CBE或ABE处理的细胞复制体都要评估其目标编辑效率,随后研究者将两组的脱靶RNA SNVs的数量与GFP对照组进行对比,他们发现,在DNA碱基编辑器处理的细胞中,RNA SNVs数量惊人地高。此外,研究人员还发现,BE3和ABE7.0处理的细胞突变偏倚分别与APOBEC1和TadA的突变偏倚相同,这就说明,脱靶效应或许是DNA碱基编辑器的过表达所引起的,此外研究者还在这些脱靶的RNA SNVs中鉴别出了CBE和ABE特异性的基序和遗传区域。

  为了消除碱基编辑器的RNA脱靶活性,研究者还分析了引入点突变对APOBEC1和TadA的影响效应,他们发现,三个高保真的变异:BE3W90Y+R126E, BE3 (hA3AR128A) and BE3 (hA3AY130F)能够在基准水平上降低RNA脱靶SNVs的水平,同样地,ABE突变ABE7.10F148A还能够完全消除脱靶效应。

  这项研究中,研究人员通过在脱氨酶中引入点突变获得了CBEs和ABEs的高保真变异,并提出了一种新方法,通过利用工程化操作手段来提高碱基编辑器的特异性。

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