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  • EMSA


    一、实验原理

    凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,现已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

    通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。


    二、应用简介

    1.研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用;

    2.可用于DNA定性和定量分析;

    3.用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。


    三、实验方法

     


    四、样本送检要求


    五、 案例展示


    六、常见问题

    1. 凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速,但要成功地进行凝胶迁移实验,需要优化一些参数,这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素:抽提液的制备(核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解),结合蛋白的浓度,探针的浓度,非特异性探针的浓度,缓冲液的配方和pH,聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件,保温时间和温度,载体蛋白,是否有辅助因子(比如锌,或镉等金属离子,或激素)。总之,反应总体积应最小(20μl)。为满足一般要求,结合缓冲液含4%甘油,1mM MgCl2,0.5mM EDTA,0.5mM DTT,50mM NaCl,10mM Tris-HCl(pH7.5),0.05mg/ml poly dI:dC,或10mM HEPES(pH7.9),50mM KCl,1mM DTT,1mM EDTA,10%甘油,0.05mg/ml poly dI:dC可作为优化实验的起始。

    2. 在DNA探针的选择上,要考虑的重要因素:目的DNA的长度应小于300bp,以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定,则应用短的寡核苷酸片段(约为25bp),这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用DNaseI印迹对蛋白结合的特异区域在DNA序列水平上作出分析。

    3. 用以下一些转录调节因子和HeLa细胞核抽提物可形成哪些复合物:AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。

    4. 当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白的来源时,每1个转录调节因子和它相关的DNA同源序列结合形成特征型的结合形态。以下的文字描述了每一个单独的转录调节因子,包括识别的同源序列,因子的大小,特定的结合条件,以及和HeLa细胞核抽提物可形成的复合物的数目。


    七、服务流程

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