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  • Western blot 检测


    一、实验原理

    Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜NC膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应, 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。其图解为:


    Western Blot显色的方法主要有以下几种:i.放射自显影ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。


    二、应用简介

    Western blot法应用分子生物学、生物化学和免疫遗传学中时常会用到的一种实验方法,并且是一种能对蛋白进行定性和半定量的分析方法。是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色,并且通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。


    三、实验方法



    四、样本送检要求


    五、案例展示

     


    六、常见问题

    其他问题 

    (1)蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应。 

    (2)蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带,然后会出现一些其他带,最主要特点是所有的条带比正常的都低,并且条带模糊不清晰。 

    (3)所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多,其次是样品弥散(比如电泳长时间停止样品弥散)。 

    (4)整个条带呈 “ ︶ ” 状:凝胶冷却不均一,电泳槽老化。 

    (5)整个条带呈“ ︵ ”: 凝胶左右两头没有凝固好。 

    (6)溴酚蓝拖尾:样品溶解不好。 

    (7)纵向的纹理:上样样品中存在不溶性颗粒。 

    (8)溴酚蓝很粗:浓缩胶浓缩效果不好,可能是浓缩胶太短,或者是浓缩胶配错。 

    (9)在分离胶中跑不动:Tris-HCl PH值不对,或者忘记加SDS。


    七、服务流程

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