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  • 流式细胞术


    一、实验原理

    流式细胞术(flow cytometry, FCM)是一项新型的、发展迅速的生物医学分析技术,它是集激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞免疫荧光化学技术 、单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。

    流式细胞仪是应用流式细胞术建立起来的仪器装置。它使细胞或微粒在液流中流动,逐个通过一入射光束,并用高灵敏度检测器记录下散射光及各种荧光信号,从而得以对粒子进行多参数分析,包括诸如粒子形状和大小、细胞周期、细胞内细胞因子、细菌表面抗原、细胞DNA内含物等。FCM检测的粒子一般为活性细胞,通过激光光源激发细胞上所标记的荧光物质的强度和颜色以及散射光的强度可以得到细胞内部各种各样的生物信息。另外FCM还可进行细胞分选,可以根据所检测细胞的某种性质进行分选,并且如果分选的过程是在无菌条件下进行的,这些细胞还可以用来培养。流式细胞仪原理如下:

     

    待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后制成样品悬液,在一定压力下通过壳液包围的进样管而进入流动室,排成单列的细胞,由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液流,并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光,由放在与入射的激光束和细胞液流成 90°处的光学系统收集之。光学系统中的阻断滤片用于阻挡激发光;二色分光镜及另一些阻断滤片则用于选择荧光波长。荧光检测器为光电倍增管。散射光检测器是光电二极管,用以收集前向散射光。小角度前向散射与细胞大小有关。

    整个仪器用多道脉冲高度分析器处理荧光脉冲信号和光散射信号。测定的结果用单参数直方图、双参数散点图、三维立体图和轮廓(等高)图来表示。
        对细胞进行分选的原理是,由超声振荡器产生高频振荡,使流动室发生振动,把喷嘴喷出的细胞液流断裂成一连串的均匀小液滴,有的液滴含有细胞。这些细胞在形成液滴前,光学系统已测定了它们的信号(代表细胞的性质),如果测得信号与所选定的要进行分选的细胞性质符合,或者说,如果发现了要进行分选的细胞时则在这个选定细胞刚形成液滴时,仪器给整个液流充以短暂的正或负电荷。当该液滴离开液流后,其中被选定细胞的液滴就带有电荷,而不被选定的细胞液滴则不带电。带有正电或负电的液滴通过高压偏转板时发生向阴极或向阳极的偏转,从而达到了分类收集细胞的目的。


    二、应用简介

    医学应用

    1. HIV免疫分型,CD4绝对计数

    2. 白血病和淋巴瘤的免疫分型

    3. 肿瘤的细胞周期和倍体分析

    4. 网织红细胞计数

    5. 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测

    6. 干细胞计数

    7. 残量白血病细胞检查

    8. HLA-B27检查

    9. 血小板功能及相关疾病

    科研应用

    1. 在免疫研究学中的应用:

    结合免疫荧光方法,流式细胞术可辨认和计数带有不同表面特异性抗原的细胞,例如用荧光素标记的免疫球蛋白鉴别T和B淋巴细胞(图3),根据细胞表面抗原的不同,进一步分辨出不同的T和B淋巴细胞亚群,以及测定每个细胞所带抗原的数量、密度及其动力学参数等。也可用流式细胞分选技术将带有“+”和不带有“-”的某种特异抗原的细胞群体分类收集,供研究其功能特性。

    流式细胞术对于判断免疫缺陷症,如爱滋病(获得性免疫缺损综合征)的重要特征,即T4和T8淋巴细胞比例改变(T4细胞大量减少)以及判断自身免疫病和确定白血病、淋巴癌的表型等,都是非常有用的。此外,流式细胞术还可用于定量分析结合于细胞上的荧光素标记的外源凝集素,测定细胞表面积和荧光素结合位点的相对密度,结合细胞动力学测定每个细胞结合位点的数目,以及研究各种外源凝集素与细胞表面结合的竞争性等。

    2. 在神经生物学研究中的应用:神经干细胞和神经祖细胞的特性研究;不同类型的神经细胞的鉴定和功能研究;检测细胞活性,细胞凋亡和细胞周期等。

    3. 在肿瘤研究中的应用:

    肿瘤细胞一般都含有异常数量的 DNA。在大多数实体瘤和急性白血病中都发现有非整倍体的细胞,由于流式细胞术样品制备方法简单,测定结果精确,能快速得到有关DNA倍性的信息,因而能提供有价值的诊断数据。如果在测量 DNA含量的同时,再测定其他参数(如不同类型的中等纤维蛋白,蛋白质含量、细胞大小、核质比等)则可进一步提高诊断的可靠性。
       流式细胞术可在实验和临床中评价肿瘤化疗和放疗的作用,现在根据流式细胞术和细胞动力学数据来监视肿瘤治疗的工作已经在实际工作中开展起来。
       此外,流式细胞术在血液学、微生物学、分子生物学等领域中也得到广泛的应用。流式细胞术正在向高灵敏、高速度、多参数测量、获取形态学信息等方面发展。

    4. 在细胞生物学和分子生物学研究中的应用:

    流式细胞术可用于测定细胞周期各时相细胞的百分比。通过测定细胞群体中每个细胞的DNA含量,得出DNA含量分布曲线。例如,在测定Hela细胞DNA含量分布曲线上,第一个峰是含有2CDNA含量的G1/G0(DNA合成前期/静止期)细胞,其次一个峰是4CDNA含量的G2+M(DNA合成后期+有丝分裂期)细胞,从2C~4C间的区域为S期(DNA合成期)细胞。采用绘图法或计算机拟合法可计算出细胞周期各时相细胞占整个细胞群体的百分数。
        用流式细胞术可进行多参数分析,即同时测定一个细胞的多种性质。如散射光和荧光,或多种不同颜色的荧光。例如细胞经吖啶橙染色后,DNA发绿色荧光,RNA发红色荧光。测定这两种荧光就能同时得知一个细胞内的DNA和RNA含量。测定结果可用二维散点图或三维立体图表示。用这种方法可根据DNA和RNA含量而鉴别出G0与G1、M期和 G2期细胞。用流式细胞术与液体闪烁技术相配合,还可求得细胞通过G1、S和G2+M期的时间(T、Ts、T+M及其变异系数。近年利用抗溴脱氧尿苷(Brdurd)单克隆抗体能发现渗入到细胞 DNA内的溴脱氧尿苷。将此种荧光抗体技术与测定细胞 DNA含量相结合,是研究DNA合成和细胞周期的一种非常有用的技术。此外,流式细胞术还可测定细胞群体同步化的程度和所处的时期,鉴别死细胞和活细胞,利用荧光标记配体,还可定量测定细胞表面和内部的受体等。

    5. 在高通量监测和新药研发中的应用:细胞功能变化的研究;细胞周期和活性;新药研发;培养基研发等。

    6. 海洋生物学:富集和分析细菌、藻类、浮游植物等。

    7. 微生物学:细菌和酵母检测;荧光蛋白检测。

    8. 生物燃料

    9. 遗传学研究:

    用流式细胞术测定染色体DNA含量,可得到染色体频率分布图,称为流式染色体核型分析。同类型染色体出现一个峰,峰的面积代表这种类型染色体的丰度。流式染色体核型分析技术不仅能快速分析核型,而且能分选出不同类型的染色体,做成人类每条染色体的DNA文库,可用于人类基因组研究、遗传病和癌症的诊断的研究。


    三、实验方法

    Step1:制成单细胞悬液(组织样本)

    Step2:溶血(细胞样本无需进行此步骤)

    Step3:离心去上清

    Step4:调整细胞密度

    Step5:加入相应的标记抗体

    Step6:孵育

    Step7:洗涤后离心去上清

    Step8:上机检测


    四、样本送检要求


    五、案例展示



    六、常见问题

    1. 待测样本量至少lml,样本应在采集后6h内处理,不可使用冷冻的标本或溶血样本。

    2. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。

    3. 确保标本上机检测前的细胞浓度为1×106/ml,细胞浓度过低则直接影响检测结果。

    4. 操作方面,保证流式细胞仪在整个工作过程中处于最佳状态,能保证定量检测的准确性和检测精度。使用标准样品调整仪器的变异系数在最小范围,分辨率在最好状态,能避免在测量过程中仪器条件的变化引起的检测误差。

    5. 在红色荧光对蓝色荧光散点图上,还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹,可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。

    6. 用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长,一般控制在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移,导致红色荧光与蓝色荧光的比例改变,从而影响结果的判断。


    七、 服务流程

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